深入解读:陈列平“自然-医学”PD-L1互补的新靶点和有望成为肿瘤免疫新秀的S15

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(特别感谢陈列平教授过目及指导)
  速读版
  继去年在Cell上发表了“免疫正?;?rdquo;理论之后,陈列平教授发文,报道了又与“正?;?rdquo;相关的表面分子。本文中,研究人员使用高通量细胞表面分子筛选的方法,找到了能够调节T细胞活性的分子Siglec-15。后续,通过体外细胞互作分析系统证实,Siglec-15在巨噬细胞上能够直接抑制T细胞活性。继而更进一步进行体外实验,发现敲除Siglec-15的小鼠的肿瘤生长降低,且使用Siglec-15单抗治疗后,可以抑制小鼠肿瘤生长。以上结果提示Siglec-15是又一个在肿瘤微环境中参与免疫逃逸的分子,且有作为治疗靶标的潜力。
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(图片由小编绘制)
  2018诺贝尔奖将医学奖授予了肿瘤免疫领域。在该领域中,陈列平教授做出了众多不可磨灭的贡献。而对于与诺奖的失之交臂,陈教授早前在“全球华人科学家生物医药创新转化30人高峰论坛”上接受第一财经采访时曾表示:“我不想过多评论诺贝尔奖,还是希望把精力放在研究上。”
  对于肿瘤免疫治疗领域,陈列平教授曾在一次外媒采访中如此评价,“在接下来的5年里,我期待着出现与PD-1/PD-L1疗法相当或更好的发现。这已经初露端倪。"
  前不久,耶鲁大学医学院陈列平教授在Cell上发表了一篇题为“A Paradigm Shift of Cancer Immunotherapy: From Enhancement to Normalization”的展望文章(点击??链接可以直接查看原文翻译稿),详尽阐述了肿瘤免疫治疗的历程、方法和现状,以及“免疫正?;?rdquo;这一理念对未来肿瘤免疫治疗的指导作用。为免疫疗法的治疗基础,未来走向及发展指出了清楚的方向。
  随着研究的深入,肿瘤的免疫正?;品ǖ尼∧徊鸥崭丈?。上个月,陈列平教授的研究刚发现了LAG-3的配体,证明了纤维介素蛋白1(Fibrinogen-like protein 1, FGL1)是LAG-3的一个重要的功能性配体,并揭示了该LAG-3-FGL1通路在肿瘤免疫中的作用。今天,陈列平教授又一最新研究成果见刊于Nature Medicine,揭示了一个全新的肿瘤免疫负调节因子Siglec-15分子在肿瘤免疫中的作用。这项研究通过严谨的论证和详实的实验展现了肿瘤免疫机制上充满魅力的一面,为找到更好的疾病治疗的方式奠定了坚实的基础。
  未解之谜
  PD-1之外,还有什么?
  T细胞的激活需要抗原启动,而细胞表面的配体-受体的相互作用则可向T细胞传导正向或者负向信号,从而决定了免疫反应的方向。通过操控这些正向或者负向反应,则可选择性地放大免疫反应,从而达到消除肿瘤的目的。除了免疫反应的程度外,产生和执行反应的位置在肿瘤免疫治疗中也是至关重要的。在肿瘤微环境(TME)中选择性地扩大或者恢复免疫反应,是高效的癌症免疫治疗方法,并且没有过多的副作用。
  近年来肿瘤免疫学在概念上的一个重要进展是发现TME中存在抑制免疫反应的自适应抵抗机制。例如,B7-H1 (CD274,PD-L1)在TME中被选择性诱导(主要由肿瘤浸润T细胞分泌的干扰素-γ),随后引发了一系列反应,包括T细胞上PD-1的参与、凋亡和衰竭信号的传递,最终导致T细胞的功能障碍。这一过程被称为适应性耐药(adaptive resistance)。特异性阻断B7-H1/PD-1通路(即抗PD疗法)可防止T细胞功能障碍并选择性恢复TME中的免疫反应。这一策略就是肿瘤免疫正?;椒?,这一方法已在临床的肿瘤治疗中被证实非常有效。
  然而,晚期人类癌症TME中的免疫逃避机制是高度异质的。大量证据表明,除了B7-H1之外,许多其他分子或细胞机制也能导致TME中免疫功能失调。这些机制包括但不限于:免疫细胞浸润不足、调节性T细胞的积聚、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和髓系来源抑制细胞(MDSCs)的存在,以及抑制性分子、细胞因子、代谢物的上调。目前抗PD治疗的成功突显了恢复TME中有缺陷的免疫反应的重要性,这是肿瘤免疫治疗正?;淖荚?。
  那么,在TME中,是否有其他的类似B7-H1/PD-1的分子在肿瘤与免疫的互作中扮演重要作用,是否有其他分子也能调节免疫反应从而调控肿瘤的发展?下面让我们随着陈教授的研究,一探究竟。
  初见端倪
  使用高通量筛选发现T细胞活性调节分子
  为了找到新的肿瘤免疫调控分子,研究者使用的高通量功能筛选系统(TCAA),借助它可以在体外实验中鉴定调节T细胞活性的细胞表面分子(图1)。这一系统包含6500多个人类基因,编码人类基因组中90 %以上的跨膜蛋白。
图1a: TCAA 原理示意图
图1a: TCAA 原理示意图
  这个系统检测系统设计非常的巧妙。借助293T细胞,研究人员制作了人工改造的抗原呈递细胞系(aAPC)。这个细胞在膜上表达针对用于T细胞受体刺激CD3片段的抗体和若干膜蛋白表达的信号接头分子。另一方面,使用Jurkat(T细胞系)来测定靶标基因及它们对T细胞活性的影响。Jurkat细胞中含有一个NF-κB or NFAT响应原件驱动的GFP报告基因。如图1b中所示,通过aAPC中表达的靶标蛋白是上调还是下调GFP的表达来判定其具体作用。在多轮TCAA筛选后,将候选分子在后续体内和体外实验中进行全面分析。TCAA筛选得的候选分子中,有若干个已经被报道的分子,如共刺激(B7-1, B7-2, CD200, CD70),凋亡(FASL, TRAIL, GZMB)或共抑制(KLRD1, BTN3A3等)。在本研究中,令人惊喜的是,Siglec-15可以持续抑制T细胞活性。
图1b: TCAA筛选结果分析示意图
图1b: TCAA筛选结果分析示意图
  有意思的是,Siglec-15最初被鉴定为Siglec基因家族成员之一,具有特征性唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素结构。已有报道Siglec-15在破骨细胞分化和骨重塑中的作用,但其免疫功能仍不清楚。前期的研究发现Siglec-15的表达通常限于髓系细胞,但是,在许多人类癌症中可能上调。蛋白序列分析显示,Siglec-15 ECD包含免疫球蛋白可变区(IgV)和恒定的2型(IgC2)区,与B7-H基因家族有超过30%的同源性。这些数据提示,Siglec-15与B7基因家族有着密切的关系,并可能与B7家族成员一样,具有免疫调节功能。
  联系到B7家族成员的作用,那么Siglec-15是否可以被应用到肿瘤免疫正?;心??后续进一步的实验提供了更多证据和线索。
  拨云见雾
  Siglec-15可抑制抗原特异性T细胞免疫反应
图2:Siglec-15在人类组织细胞的mRNA水平分布
图2:Siglec-15在人类组织细胞的mRNA水平分布
  Siglec-15在大多数正常人体组织和各种免疫细胞亚群中mRNA水平很低,但在巨噬细胞中有较高表达(图2)。对源自M-CSF刺激单核细胞的人巨噬细胞进行分析后,也验证了此结果。相似的是,在正常小鼠组织中也检测不到Siglec-15 mRNA,而Siglec-15 mRNA在骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)中有低水平表达,但在骨髓源性树突状细胞(BMDCs)中不存在,即使在LPS刺激后也是如此。为了进一步鉴定其功能,研究者构建了Siglec-15全身敲除小鼠 (S15KO)。通过野生型和KO小鼠的对比分析显示,Siglec-15在三种细胞中低表达:1) CD11b+ F4/80+腹膜巨噬细胞;2) 新分离骨髓的CD11b+ Gr-1+骨髓细胞;3) CD11b+ F4/80+BMDMs,在其他骨髓或淋巴细胞亚群中则无法检测到。
图3:IFN-γ处理后,RAW264.7巨噬细胞系Siglec-15表达下降。
图3:IFN-γ处理后,RAW264.7巨噬细胞系Siglec-15表达下降。
  对于B7-H1(PD-L1)来说,IFN-γ是诱导B7-H1表达的主要细胞因子,那么它对Siglec-15表达的影响如何呢?结果显示IFN-γ抑制了小鼠骨髓细胞系RAW264.7上Sigelc15的表达 (图3)。此外,IFN-γ还抑制M-CSF诱导的人单核细胞来源巨噬细胞上Siglec-15的表达。因此,Siglec-15表达的调节不同于B7-H1。随后研究者利用体外细胞互作分析系统证实,Siglec-15在巨噬细胞上能够直接抑制T细胞活性。
  对S15KO小鼠长达18个月的观察显示,该类小鼠没有表现出明显的疾病表型,它们的体重、淋巴器官重量和血清抗核抗体都在正常范围内。这表明,Siglec-15对小鼠发育或免疫系统稳态并不重要。
  为了评估Siglec-15在体内抗原特异性T细胞应答中的免疫抑制功能,将来自Rag-1 KO背景下OT-I TCR转基因小鼠脾脏的OT-I细胞分别输入至WT或S15KO小鼠中,次日用OVA257-264肽+Poly (I:C)作为佐剂免疫小鼠。与WT小鼠相比,S15KO小鼠中来自血液(第4天)和脾脏(第5天)的OT-I明显更多。并且,OT-I增殖水平在S15KO小鼠也更高。因此,Siglec-15似乎是通过调节细胞生长来抑制抗原特异性T细胞反应。随后,为了确定巨噬细胞相关Siglec-15在体内诱导T细胞反应中的作用,研究者制备了Siglec-15缺失的巨噬细胞/粒细胞。在OVA257-264免疫后,在血液中评估OT-I在体内的增殖。体内T细胞扩增的动力学分析表明,与WT小鼠相比,S15KO小鼠中的OT-I的增殖率显著升高。上述结果表明巨噬细胞/髓细胞上的Siglec-15抑制体内T细胞应答。
  原形毕露
  Siglec-15在人肿瘤细胞中表达丰富,缺失后降低小鼠肿瘤生长
  进一步在人类肿瘤上研究了Siglec-15在肿瘤上的作用。TCGA分析表明,Siglec-15 mRNA众多癌症中表达上调。它在结肠癌、子宫内膜样癌和甲状腺癌中大多上调;且相较于相应的正常组织,膀胱癌、肾癌、肺癌和肝癌中也显著上调。Siglec-15 mRNA含量与几个免疫信号基因呈反比,如人膀胱癌中的CD3E、IFNG和GZMA或GZMB。
?图4:NSCLC样本的免疫荧光染色
图4:NSCLC样本的免疫荧光染色
  使用人Siglec-15抗体在来自241个非小细胞肺癌(NSCLC)样品的组织芯片中进行免疫组织化学分析,定量免疫荧光(QIF)染色分析表明Siglec-15可在肿瘤细胞和间质细胞中被检测(图4),25.7 %的样本呈阳性。有趣的是,B7-H1(PD-L1)和Siglec-15表达之间没有相关性,只有7/218(3.2%)的患者呈双阳性(图5)。利用NCI-60 panel在多种人肿瘤细胞系中发现了高水平的Siglec-15 mRNA,该结果与肿瘤细胞相关的Siglec-15表达一致。
?图5:Siglec-15与B7-H1的表达相关性分析
图5:Siglec-15与B7-H1的表达相关性分析
  接下来研究者进一步研究了Siglec-15在肿瘤发生发展中的作用。为了更好地模拟具有大量Siglec-15阳性的肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated microphage, TAM)的人类癌症,作者使用了B16-GMCSF细胞系,该细胞系过表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在B16-GMCSF肿瘤中,TAMs的Siglec-15染色呈阳性,但在T或B细胞上无染色。使用该细胞系分别接种S15KO和WT小鼠后,S15KO鼠的肿瘤生长降低,生存期延长。利用CyTOF分析两种小鼠中免疫细胞亚群的分布显示,两者存在显著不同:在S15KO小鼠中,CD8+ T细胞和NK细胞显著增加。此外,有趣的是,S15KO肿瘤中,数个炎性髓系细胞群(CD11b+ MHC-IIhi B7-1+ B7-H1Med F4/80Low)显著增加,而CD11b+ MHC-IIlow B7-1Med B7 - H1Low F4/80Med肿瘤相关巨噬细胞和CD11b+ Ly6G+髓源抑制性细胞都有减少。此外,使用单抗去除CD8+T细胞后,B16-GMCSF的生长在S15KO和野生型小鼠中并无区别。
  此外,在G261(神经胶质瘤)模型中,也观察到了类似的现象,提示Siglec-15显著抑制肿瘤特异的CD8+T细胞应答。这些数据表明Siglec-15在巨噬细胞介导的肿瘤免疫抑制中的作用。
  利剑出鞘
  Siglec-15单抗的抑癌作用
  为了进一步探究Siglec-15在肿瘤治疗中的潜力,作者使用杂交瘤技术制备了Siglec-15特异性mAb (α-S15,克隆5G12 ),并先测试了α-S15对B16-GMCSF小鼠模型的影响。α-S15治疗后,B16-GMCSF肿瘤的生长产生了中等程度的影响。由于Siglec-15在人类癌症中有独特调节机制和表达分布,它在免疫调节中与B7-H1/PD-1途径无关。当与WT BMDMs共培养时,α-S15可促进PD-1 KO T细胞的反应。与其一致的是,无论是否存在PD-1阻断抗体( Nivolumab ),α-S15都能有效促进人外周血T细胞产生细胞因子。(图6)
图6:抗CD3和SEB刺激后,α-S15和 Nivolumab对人PBMC分泌IL-2和TNF-α 的影响
图6:抗CD3和SEB刺激后,α-S15和 Nivolumab对人PBMC分泌IL-2和TNF-α 的影响
图7:α-S15和抗PD-1单克隆抗体对肿瘤生长的影响
图7:α-S15和抗PD-1单克隆抗体对肿瘤生长的影响
  更加令人喜出望外的是,虽然α-S15和抗PD-1单克隆抗体作为单药使用时,能适度抑制肿瘤生长,但两种单克隆抗体的合并治疗能有更佳的疗效,在一些小鼠中肿瘤出现完全消退(图7 )。这一观察进一步支持了Siglec-15能够独立于B7-H1/PD-1途径发挥作用,抑制免疫反应;此外,阻断Siglec-15可以与抗PD疗法一起用于癌症治疗。且在小鼠中移植人源肿瘤细胞的模型中,α-S15的治疗显著抑制皮下MC38-S15+肿瘤生长,并且在静脉注射肿瘤细胞中,肺内的转移性肿瘤结节明显减少。所以,这些研究结果表明,巨噬细胞来源或肿瘤来源的Siglec-15可以减弱抗肿瘤免疫,这是TME中一种新的免疫逃避机制,并且,使用特异性单克隆抗体阻断Siglec-15的抑制功能可以治疗这些肿瘤。
  未来展望
  肿瘤免疫疗法经历了一个范式转变,从通过增强免疫系统激活免疫反应,到通过免疫正?;≡裥缘鼐勒齌ME中的免疫缺陷。这种肿瘤免疫正?;瘟撇呗灾械陌斜晷枰舷率鎏跫? )因肿瘤生长和/或随后的免疫监视而诱导;2 )在TME中优先表达,正常组织中表达少,3 )能够引发免疫逃逸,并且调控该免疫逃逸可以重置或重编程TME中的抗肿瘤免疫?;谝陨咸卣?,肿瘤免疫治疗可以在没有过度自身免疫毒性的情况下获得可观的治疗效果。
  Siglec-15最初被归类为Siglec家族,根据系统发育分析,它不同于其他家族成员。它显示出与B7-H1以及许多其他B7家族成员相似的结构域成分和高度同源性。重要的是,Siglec-15和B7-H1在人肺癌组织中的表达是互斥的,表明它具有一种独特的调节机制。Siglec-15不与目前已知的免疫抑制受体结合,也不与B7-H1、PD-1、B7-1或任何其他已知的B7家族配体或受体相互作用。
  陈列平教授的这项研究说明,Siglec-15是一个具有吸引力的肿瘤免疫治疗靶点:首先,Siglec-15在正常组织中的表达有限,Siglec-15缺陷对小鼠的正常生理影响极小,表明Siglec-15不是正常器官和组织生存和生长的必要分子,这可能是Siglec-15阻断疗法安全性基础。第二,Siglec-15在TAMs和肿瘤细胞中上调,但在正常组织中不上调,表明Siglec-15的作用局限于TME,这为选择性靶向抗体治疗提供了条件。第三,使用Siglec-15缺陷小鼠进行的肿瘤模型研究表明,Siglec-15对肿瘤部位的T细胞反应具有强大的免疫抑制作用,这种作用由TAM相关的Siglec-15介导。最后,Siglec-15特异性mAb能够逆转T细胞抑制,促进肿瘤免疫,并在多种肿瘤模型中抑制肿瘤生长。总的来说,该研究发现Siglec-15是有效的免疫抑制分子。由于Siglec-15的这些特性,抗Siglec-15 mAb对目前对无法使用抗PD治疗的癌症患者而言,多了一种选择。
  后记
  值得一提的是,在2018世界生命科学大会上,列平教授宣布针对Siglec-15的临床实验已经开展,将在包括非小细胞肺癌、卵巢癌在内的多种实体瘤中进行Ⅰ/Ⅱ期临床研究,我们期待捷报的到来。
?(陈列平,2018世界生命科学大会,图片由董增军提供)
?(陈列平,2018世界生命科学大会,图片由董增军提供)
(陈列平,2018世界生命科学大会,图片由董增军提供)
  对于抗PD疗法的成功和肿瘤免疫疗法的兴起,列平教授曾多次提醒,需要不断在经验中学习,他曾说:“但最重要的是我们学到了什么,这些发现如何指引我们。这是最激动人心的[部分]。”我们看到列平教授秉持并践行了这一理念,Siglec-15只是正?;∧唤铱蟮囊宦乒?,期待更多的分子被发现,继而催开一片花。
  首图中的图片来自Yale,Nature Medicine和论文,由小编组合。文内图片除注明外,均来自该发表的论文,原文链接: (www.nature.com/articles/s41591-019-0374-x)。
 
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责任编辑: 夢奕新
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