伴平滑肌瘤样间质的肾细胞癌:一组组织病理学特征不明,但有2种不同基因谱的肿瘤: 6例VHL基因畸变阴性的病例二代测序分析

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  摘要
  我们研究了一组伴平滑肌间质的肾细胞癌(RCCs)(N=6),它们缺乏下列任何遗传畸变:VHL基因编码序列突变、3p染色体杂合性缺失,或VHL超甲基化。利用靶向二代测序技术,未鉴定出基因内VHL突变或参与血管生成有关的基因突变、以及透明细胞RCC中常见突变的基因。肿瘤也被进行了TCEB1基因的热点突变,但所有病例结果均为阴性。我们的结论是存在一组伴丰富平滑肌瘤样间质的RCCs,其中上皮成分与普通的透明细胞RCC无法区别,但与透明细胞(管状)乳头状RCC不同,并且这些肿瘤缺乏与VHL基因功能相关的畸变,以及涉及血管生成的基因突变和TCEB1基因的热点突变。
  具有丰富的间质平滑肌/平滑肌瘤样成分的肾细胞癌(RCCSMSs)是不常见的肿瘤,1993年由Canzonieri等人首次报道和描述。随后,在2006年,Kuhn等人和其他研究人员完善了RCCSMS的资料。顾名思义,RCCSMSs是由2种不同的组织成分组成:上皮和间质。上皮成分由排列成以巢状或管状为主的腺瘤样结构的透明肿瘤上皮细胞组成,但局灶可见到乳头和实性区域。已经证实间质平滑肌成分本质上是反应性/多克隆性。我们最近发现,RCCSMS除了富含平滑肌的间质外,上皮成分在光镜下与“普通”的透明细胞RCC无法区分。 尽管在光镜或免疫组织化学上没有差异,但在分子遗传学水平上,我们能将这些肿瘤分成两组:(A)VHL阳性和(B)VHL阴性。VHL阴性肿瘤包括VHL基因的编码序列没有突变、3p染色体杂合性丢失(LOH)或VHL促进子超甲基化。本研究的目的进一步确定VHL阴性RCCSMS的分子遗传学特征。为此,我们通过靶向二代测序对VHL基因的整个区域以及一组在透明细胞细RCC中频繁突变和参与血管生成的基因进行了突变分析。
  材料与方法
  在捷克查尔斯大学皮尔森医学院Sikl's病理学系机构和会诊档案的18500例肾肿瘤及肿瘤样病变中,检索到13例RCCSMS。组织均已经中性福尔马林固定,石蜡包埋;4mm厚切片并进行HE染色。对所有病例进行了基本的免疫组化分析(结果未显示)。所有肿瘤均由排列呈巢状或管状的胞质透明的上皮细胞组成,混合伴丰富的平滑肌瘤样间质(图1.A- C)。11例(7例VHL阳性和4例VHL阴性)病例已经在我们以前的研究中描述过。4例来自于我们以前的研究和2例新的病例被选作当前研究。用于本研究中已经描述过的病例见表1。所有6例VHL阴性亚组均进行了NGS研究。蜡块选用主要由上皮成分组成伴极少的平滑肌瘤样间质。
伴平滑肌间质的肾细胞癌
  图1. 伴平滑肌间质的肾细胞癌。在选定的肿瘤中存在不同数量的纤维平滑肌瘤样间质。A.在某些病例中,间质丰富并形成实性区域。B.在其他肿瘤中,间质以条索状和粗线状分割上皮成分。C.上皮成分与“普通”的透明细胞肾细胞癌中的细胞相同。
  DNA的提取
  来自于巨切割肿瘤组织中的DNA提取采用使用QIAsymphony DNA Mini 试剂盒 (Qiagen, Hilden, Germany) 在自动抽提系统(QIAsymphonySP, Qiagen)上进行,具体操作根据制造商对FFPE样品的补充步骤进行(来自于FFPE组织的基因组DNA纯化采用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒和脱脂溶液)。使用NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, DE)测定分离的 DNA的纯度。Qubit荧光计(Life Technologies)用于测量其浓度。在多重聚合酶链反应(PCR)中通过扩增控制基因检查DNA的完整性。
  突变分析
  VHL基因突变分析、VHL促进子的超甲基化、3p位点的杂合性缺失,7号和17号染色体的非整倍体检测采用以前描述的方法进行。TCEB1热点(Tyr79和Ala100)的突变情况采用定制引物进行Sanger测序。
  使用二代测序对VHL区和癌症基因组合进行分析
  SureSelect目标富集系统(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)用于检测VHL基因区域的内含子和非编码变异体。一个带有3×tiling密度跨越3P染色体14.7 kbp(chr3:10180682-10195365 HG19)的定制组合被设计出来。根据制造商的说明书使用 Ion Xpress Plus Fragment Library kit (Life Technologies) 和 SureSelect 定制捕获试剂盒来准备文库。两套基因组合被用来检测已知致癌基因和肿瘤抑制基因的突变。First Cancer Hotspot Panel版本2覆盖50个基因的热点突变,随后,一个更大的综合癌症组合覆盖完整编码序列或涉及癌症发生仅400个基因的一部分 (Life Technologies, part of Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)被使用。
  根据制造商的说明书制备文库,并使用Hi-Q试剂盒在OneTouch2循环仪上进行乳化PCR和测序。测序在Ion Torrent 个体化基因组测序仪(Sureselect 定制组合和癌症热点组合) 和Ion Proton (综合癌症组合)上进行。样本倍增的目的是产生最小的覆盖率500×。使用Torrent Suite软件4.2版(Life Technologies)进行信号处理、测绘和质量控制。使用相应的预设工作流程采用Ion Reporter4.2版本对序列变异体注释。使用在线工具(NetGene2,Human Splicing Finder)对VHL非编码区发现的所有变异体进行检测,以检测剪接可变的变异体。随后,对在基因组合中发现的变异进行筛选,只包括外显的、非同义变异体,其变异等位基因频率高于15%。使用现有的在线数据库和文献手动过滤所有变异体。所有包括在UCSC(UCSC,加州大学圣克鲁兹分校)共同SNP(单核苷酸多态性)和/或由NCBI(美国国立生物技术信息中心)ClinVar数据库标记为良性的变异都被排除在外。两个另外的无关样本的福尔马林固定石蜡包埋的正常组织作为对照进行了测试。在两个对照组织中发现的变异体被认为是PCR的假象而排除。
  结果
  基本的临床病理学资料见表1。我们的病人队列包括6名患者。其中4例已被部分分析并在我们之前的研究中描述过。
表1 基本的临床病理学资料
基本的临床病理学资料
  病例1-4,之前的研究描述过。
  患者包括3名男性和3名女性。他们的年龄在53~69岁之间(平均年龄62.2岁;中位年龄63岁)。肿瘤大小在1.5~2.5 cm之间(平均2.12cm,中位1.9 cm)。仅2位患者获得随访资料,且他们在治疗后1年和1年半均无复发或转移迹象。
  对6例VHL阴性病例中进行了整个VHL区域的测序(表2)。4个可分析的样品通过生物信息学分析发现内含子剪接位点可变性突变均是阴性。其他2个样本重复也未能产生可用的文库。通过二代测序在VHL阴性亚组中没有发现癌症热点组合中覆盖区域的突变。所有6例随后使用癌症综合组合进行分析。2例样本产生了成功测序的足够质量的文库。该组合包括涉及血管生成的12个基因(CDH5、EPHB4、ERBB2、FGFR3、FLT1、FN1、HIF1A、ITGB3、KDR、MMP2、THBS1、TIMP3)几乎完整的编码序列(98%),以及透明细胞RCC中10个最常见突变基因(VHL、PBRM1、SETD2、BAP1、MTOR、TCEB1、PIK3CA、KD5C、TP53、PTEN)中的93%。这些区域均未发现突变。在表3中列出了病例5和6中发现的筛选出的变异。上文讨论的所有区域的最小覆盖率> 500×。用于筛选的突变等位基因比率被设置为15%,仅包括普遍存在的突变。
表2.分子遗传学检测结果
分子遗传学检测结果
  *病例见于以前的研究中
  CCP,通过NGS分析的综合癌症综合组合;CEP7和CEP17,7号和17号染色体的非整倍体检测;CHPv2,通过NGS分析的癌症热点组合;D,二体性;LOH 3p,3p杂合性缺失分析;Methyl VHL,促进子的超甲基化分析;NA,不可分析;Neg,阴性;Pos,表3中列出的阳性变异体;VHL,采用Sanger测序的VHL基因的突变分析;VHL region,VHL区域的二代测序
表3. 综合癌症组合中发现的突变
综合癌症组合中发现的突变
  基因符合:根据HGNC的基因命名。
  转录:用于变异描述的参考序列。
  蛋白质:根据HGVS在蛋白质水平上的命名推导变异体的描述。
  编码:根据HGVS的命名在编码DNA水平上对序列变异体的描述。
  dbSNP:dbSNP数据库中的参考SNP标识符。
  RCC中的突变:肾组织中有致病性点突变的样本百分比(来自COSMIC数据库)
  讨论
  多克隆、反应性富于平滑?。ㄆ交×鲅┘渲适且恢址翘匾煨缘?、多克隆、反应性改变,可在多种肾肿瘤中见到。Canzonieri 等人首先描述了由透明细胞成分伴显著间质成分组成的RCCs,随后由其他研究者描述。早期,这组富含平滑肌的肿瘤被冠以各种各样的名称,但最常见的术语是伴平滑肌间质的肾细胞癌(RCCSMS)。RCCSMS是一个纯粹的描述性术语,并且如上所述,现已证明反应性平滑肌间质成分可以在多种肾肿瘤中发生。因此,RCCSMS不是一个独立的临床病理学实体。
  RCCSMS未被列入新版WHO 2016肾脏肿瘤分类中。正式地,它应该被诊断为未分类的肾细胞癌。
  在最近的研究中,我们观察到在一组“RCCSMS”中,上皮成分显示普通的透明细胞肾细胞癌的组织学特点和免疫组织化学特征,我们能根据分子遗传学研究分为两个亚组:(A)肿瘤有VHL基因(编码序列)的突变,或3P杂合性缺失,或VHL基因的启动子甲基化;(B)不伴有上述改变的肿瘤。80%以上透明细胞RCCs的VHL基因是失活的,由于VHL可能是由基因内突变失活,我们在这个研究中对整个VHL基因区域进行了测序。所有通过VHL区二代测序可分析的肿瘤(4/6)对于通过生物信息学预测的任何剪接可变变体都是阴性的。2例进一步通过二代测序综合癌症组合进行研究,没有发现如综述文章中所列出的透明细胞RCC中10个最常见的突变基因的突变。需要强调的是,我们坚决认为,局灶性CK7的表达并不否定对透明细胞RCC的诊断。CK7表达被重复证实在具有与透明细胞RCC一致的光镜特征和分子遗传改变的肿瘤中。
  重要的是,本研究中没有1例肿瘤显示透明细胞乳头状RCC的组织病理学特征,后者在新的2016版WHO分类中与肾血管平滑肌腺瘤样肿瘤是同义词。另外,我们不能发现任何在透明细胞乳头状RCCs中见到的重要的分子遗传学异常。在一组CCPRCC使用同一基因二代测序组合的相同研究中,发现了2个MET突变。这两个突变之一是NP_000236.2:p.Thr992Ile (rs56311081),这是文献中讨论的一个变异,并且不被认为在各种恶性肿瘤中具
  有任何转化能力。另一个突变NP_000236.2:p.Asn375Ser(rs33917957)在NCBI的ClinVar数据库中被作为一种良性多态性而描述。这项研究中,我们在一个样本中确定了一个不同的MET突变(NP_000236.2:p.Ser156Leu)。我们尚未能追踪或阐明在文献中肿瘤中可能的作用??悸堑組ET基因突变在包括乳头状RCC、甲状腺癌和慢性淋巴细胞白血病在内的其他几种恶性肿瘤中已经被提及的事实,我们认为我们病例中的一例存在MET基因突变不是代表“VHL阴性RCCSMS”的遗传学畸变。使用我们的标准在2例分析的病例中(5和6),筛选出13个其他突变。根据COSMIC数据库,所有这些突变以前在各种RCCs样本中描述。报告给COSMIC具有病理性突变的样本百分比见表2。这些基因的突变率最高的是MET,其中大部分来自乳头状RCC,一些来自透明细胞RCC。然而,重要的是要记住,本研究获得的数据不足以区分驱动基因和过路基因的突变。同样,我们队列中采用二代测序组合所识别的突变都不能归因于RCCSMS的VHL阴性亚组的特异性。然而,基于这些数据,我们的发现强烈地反对所提出的机制,即间质平滑肌过度生长与VHL基因失活的上皮性肿瘤细胞过度生成生长因子有关。
  Martignoni等人提出,RCCSMS是一种不同于透明细胞RCC的肿瘤,这些肿瘤可能与透明细胞乳头状RCC有关。我们的观点与此不同。然而,在开始讨论这个话题之前,最重要的是要详细说明在使用“RCCSMS”这个术语时实际指的是什么。首先,如上所述,各种各样的肾肿瘤可显示这种间质改变,这应允许排除这些特定的疾病实体,如普通乳头状RCC、透明细胞乳头状RCC等。第二,按照前面的说法,“RCCSMSs”显示透明细胞RCC的分子遗传学变化,即VHL基因(编码序列)的突变,或3p杂合性缺失或VHL启动子超甲基化,应分类为透明细胞RCC。剩下的一组肿瘤,暂时认为是“真正的”RCCSMs,定义为上皮细胞成分与透明细胞RCC无法区分,但缺乏在透明细胞RCC中常见的上述特征性遗传畸变。这就提出了一个重要的治疗问题,即这些肿瘤是否应该用靶向药物(抗血管生成药物或其他已经可用的抑制剂)治疗。与此一致,在2个可分析的样本(病例5和6)中,我们发现在血管生成中活化的12个基因中没有突变。另一个推测性问题是这些透明细胞RCC样肿瘤是否可以在没有平滑肌间质存在的情况下发生,因此,历史上一系列的透明细胞RCC是否可能包含这样的肿瘤,类似于我们有限的队列,其中包含2种生物/遗传上的独立,但形态学上难以区分的肿瘤类型。这种现象在头颈部基底样鳞状细胞癌病例中已经注意到,具有相同组织病理学特征的肿瘤,大多数取决于亚单位(鼻咽、口咽等) ,与EB病毒、人乳头状瘤病毒有关,或有非病毒病因。
  有人提出,TCEB1基因突变的肾细胞癌可能代表肾细胞癌的一种“独特的基因组和形态学亚型”。作者检查了一组由透明细胞组成的肾肿瘤,根据他们的观点,这些肿瘤不同于透明细胞乳头状RCC和透明细胞RCC,并且具有TCEB1基因(Tyr79和Ala100)中的热点畸变/突变。我们在6例VHL阴性RCCSMs中未检测到任何TCEB1突变。根据参考文献中的说明,我们无法发现TCEB1突变性RCC与我们未检出VHL基因相关异常的RCCSMS病例之间有任何令人信服的形态学差异。我们认为,仅通过分子遗传学分析,至少可以区分具有相似形态结构的RCC(透明细胞和显著的平滑肌瘤间质)的一个潜在亚组。
  总之,存在一组具有大量平滑肌瘤间质的RCCs,其中上皮成分与普通透明细胞RCC无法区别,与透明细胞(管状)乳头状RCC不同。这些肿瘤缺乏与VHL基因功能相关的畸变、血管生成相关基因突变和TCEB1基因热点突变。
  原文出处:Petersson F, Martinek P, Vanecek T, et al. Renal cell carcinoma with leiomyomatous stroma: A group of tumors with indistinguishable histopathologic features, but 2 distinct genetic profiles: Next-generation sequencing analysis of 6 cases negative for aberrations related to the VHL gene. Appl Immunohistochem Mol Morphol,2018,26(3):192-197
责任编辑: 夢奕新
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